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    IHC全攻略8:问题到底出在哪儿?

 摘要:

  从技术上说,IHC和ICC实验并不难,然而,每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳,实验结果不太好,那么我们可能要做个 troubleshooting,看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题,以及相应的对策。

从技术上说,IHC和ICC实验并不难,然而,每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳,实验结果不太好,那么我们可能要做个troubleshooting,看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题,以及相应的对策。

问题1:缺乏染色

可能原因

对策

缺乏抗原

通过原位杂交检查蛋白表达。

因储存不当,抗体不起作用

按照说明书上的说明储存。一般来说,将抗体分装成小份,足够单次实验使用。将这些抗体储存在手动除霜的冰箱中(-20 to -70 °C),避免反复冻融。

一抗或二抗失活

独立检测报告系统,以评估试剂是否有用。

组织固定不足

尝试增加固定时间或换一种固定剂。

组织过度固定

减少浸润或固定后步骤的持续时间。如果浸润固定无法避免,那么通过抗原修复试剂,让抗原不被遮蔽。

一抗与二抗不兼容

使用能与一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗来自兔子,那么就使用抗兔的二抗。

在固定或包埋过程中表位已改变

通过各种抗原修复技术尝试恢复免疫反应性。

58°C或以下包埋组织。

抗原修复不起作用

增加处理时间或改变处理溶液。

试剂遗漏或顺序不对

重复染色过程,确认使用了正确的试剂,并以正确顺序添加。

 

问题2:高背景

 

可能原因

对策

一抗或二抗的浓度高

滴定抗体,以确定促进一抗和二抗的特异反应所需的最佳浓度。。

组织中抗体和蛋白的疏水相互作用

降低抗体稀释液的离子强度(特别是单克隆抗体)。

一抗或二抗与组织的非特异结合

在一抗孵育之前采用封闭步骤(通常使用1% BSA10% 正常驴血清)。脱脂奶粉也是个选择。

二抗的非特异结合

使用交叉反应性IgG被去除的抗体。

组织变干

在染色过程中避免让组织变干。

离子相互作用引起的背景

提高稀释液的离子强度。

 

问题3:细胞/组织形态被破坏

 

可能原因

对策

抗原修复方法太过剧烈

根据经验确定实验条件,既能保留组织形态,又能恢复抗原的免疫反应性

组织切片从玻片上脱落

增加固定时间。根据经验确定另一种固定剂。

组织切片撕裂或折叠。切片下有气泡

重新切片,或在分析结果时忽略受损区域。

组织形态的分辨率差

切出更薄的组织切片。冰晶可能会破坏冰冻切片的形态。

固定不足在染色过程中会导致组织或细胞受损

延长固定时间。提高固定剂/组织的比例。切出更小的组织,以便更彻底的浸润。

组织自溶导致坏死碎片的染色

延长固定时间、比例。考虑使用交联的固定剂。

 

问题4:染色不当

可能原因

对策

固定方法不当

尝试另一种固定剂,或延长固定时间。

抗原修复可能不当

尝试另一种抗原修复条件。

抗原的静电荷被改变

尝试调整抗体稀释液的pH或阳离子浓度。

固定拖延导致抗原扩散

快速固定组织。尝试交联固定剂,而不是有机固定剂。

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